Клетканы зерттеу әдістері

Қазіргі кезде цитологияның зерттеу тәсілдері мен әдістері әр алуан. Цитологиялық әдістерді оптикалық, цитофизикалық, ультрақұрылымды зерттеу, цитохимиялық, гистохимиялық және т.б. әдістерге топтастыруға болады. Клетка органоидтарының құрылысы, ультрақұрылымы мен функциясы жарық және электронды, қараңғы өрісті, фазалы-контрасты, поляризациялы, люминесцентті микроскопия және тағы басқа әдістер арқылы зерттеледі.

Жарық және электронды, қараңғы өрісті, фазалы-контрасты, поляризациялы, люминесцентті микроскопия әдістері фиксацияланған клеткалардың құрылысы мен ультрақұрылымын зерттеуге қолданылатын болса, дифференциалды центрифугалаудың көмегімен алынған жеке органоидтар цитохимиялық, биохимиялық, биофизикалық және т.б. әдістермен зерттеледі.

Цитологияда негізгі қолданылатын әдістердің бірі – жарық микроскопы тәсілі. Жарық микроскопия әдістерінде объект арқылы жарық шоғы өтіп, объектив линзалар жүйесіне түсіп, алғашқы сурет пайда болады да, окуляр линзаларының көмегімен ұлғаяды.

Оптикалық жүйе ретінде микроскоптың басты сипаты – шешушілік қасиеті, яғни бір-біріне жақын орналасқан екі объектіні жеке-жеке көрсету. Микроскоптың шешуші қабілеті жарық толқынның ұзындығымен есептеледі: толқынның ұзындығы неғұрлым қысқа болса, соғұрлым шешуші қабілеті жоғары. Жарық микроскопта көбінесе спектрдің көру облысындағы жарық көзі (400-700 нм) қолданылады, сондықтан бұл жағдайда микроскоптың максимальді шешуші қабілеті 200-350 нм-ден жоғарыламайды (0,2-0,35 мкм). Яғни жарық микроскопының шешуші қабілетінің соңғы деңгейі жарықты көру аймағын пайдаланғанда 0,2-0,3 мкм тең.

Қараңғы өрісті микроскопия. Қараңғы өрісте препараттарды арнайы конденсордың көмегімен қарастырады. Қараңғы өрісте бақылау кезінде объектіге жарық шоғының сәулелері түспейді, оның орнына шоқтың шеттік сәулелері қолданыс табады. Шеттік сәулелер объективке түспейді, сондықтан микроскоптың көру аумағы қараңғы болады да, шашыраңқы жарықпен көрінген объект ашық түсті болып көрінеді. Клетка препараттарында түрлі оптикалық тығыздықтағы құрылымдар болады. Жалпы қараңғы өрісте бұл құрылымдар түрлі жарықтандырулардың көмегімен анық көрінеді. Жарықтандыру кезінде жасушада жарық сәулелеріндегі шаңдарға ұқсас (Тиндаль эффектісі), өте ұсақ, кішкентай бөлшектер (0,2 мкм-нен кем) жарқырайды, шағылысқан жарық сәулесі микроскоп объективіне түседі.

Бұл әдіс тірі клеткаларды зерттеуде жиі қолданылады.

Фазалы-контрасты (фазасы қарама-қарсы) микроскопия әдісі. Клетканың кейбір бөліктері жұқа болғанымен, бір-бірінен тығыздықтары мен жарықсындырғыштықтарымен ерекшеленеді, клеткалардың осындай қасиетіне фазасы қарама-қарсы микроскопия әдісі негізделген. Фазалы-контрастық микроскоптың объективіне арнайы пластинка қондырылған, сол пластинка арқылы жарық сәулесі тербеліс фазасының қосымша жылжуын сезеді. Суретті қалыптастыру кезінде бір фазада немесе қарама-қарсы фазада болатын, бірақ әр түрлі амплитудалы сәулелер өзара қарым-қатынасқа түседі, соның салдарынан объектінің ашық қою түсті контрасты суреті пайда болады. Фазалы контрасты микроскоптың ерекшелілігі – тірі клеткаларды, боялмаған объектілерді зерттеуге мүмкіндік береді.

Интерференциялы микроскопия әдісі жарықтың екі полярланған сәулелерінің бірі объект арқылы, енді біреуі объектінің қасынан өтуіне негізделген. Бұл жағдайда бірінші сәуленің фазасының кешігуі туындайды. Осы сәулелердің қабаттасуы (интерференциясы) суреттің пайда болуын туғызады. Егер екі полярланған сәулелердің екі толқынының аралығындағы арақашықтық толқын ұзындығының толық санына тең болса, сурет ақшыл өрісте қара түсті дақ ретінде көрінеді, ал егер де екі толқын арасындағы арақашықтық жартылай толқындардың тақ санына тең болса, сурет қараңғы өрісте ақшыл дақ ретінде суреттеледі.

Интерференциялы микроскопта сәулені екі перпендикуляр жазықтықта поляризациялау конденсордың фокальды жазықтығында орналасқан поляризатор мен кварцтан жасалған Волластон призмасының көмегімен жүреді. Волластонның екінші призмасы осы екі сәулені объективтің артқы фокальды жазықтығында жинақтайды.

Интерференциялы микроскоп көмегімен тірі объектілерді бақылауға болады, сондай-ақ клетка құрылымдарының құрғақ салмағы, клеткадағы құрғақ затпен судың концентрациясы, құрылымдардың қалыңдығы туралы мәліметтер алуға болады. Мұндай мәліметтер алу үшін микроскоптың тубусының жоғарғы жағында орналасқан компенсатор қолданылады.

Рентген сәулелерін сіңіру тәсілі. Әр түрлі заттар толқындардың белгілі бір ұзындықтарында рентген сәулелерін әр қалай сіңіреді, міне осы қасиетке рентген сәулелерін сіңіру әдісі негізделген. Спектрорентгенограмма көптеген заттар үшін белгілі. Рентген сәулелерін ұлпадан жасалған препарат арқылы өткізе отырып, сіңіру спектрі көмегімен оның химиялық құрамын анықтауға болады. Осы әдістің көмегімен микрофотографиялардан клеткадағы құрғақ заттардың құрамы анықталады. Фотосуретке түсіретін құрылымда заттың концентрациясы неғұрлым көп болса, соғұрлым эмульсия аз жарқырайды. Сіңірілуші заттың концентрациясы сол заты бар құрылымның суретінің қараюымен анықталады. Оптикалық тығыздық формуланың көмегімен есептелінеді.

Флуоресценциялық микроскопия. Тірі клеткаларды зерттеуге флуоресценциялы бояғыш заттар және флуоресценциялық микроскопия әдісі кеңінен қолданылады. Бұл әдістің негізінде кейбір заттардың ультракүлгін сәулелерінде флуоресценциялану қасиеті жатыр. Мұндай флуоресценцияны ұлпадан шығаруға болады, ол үшін ұлпа арқылы ультракүлгін сәулелерінің шоғын өткізу керек. Бұл мақсатта конденсорда жалпы жарық шоғынан көк және ультракүлгін сәулелерді бөлетін жарық фильтрі орналасқан арнайы ультракүлгінді микроскоп қолданылады. Бақылаушының көзінің алдында орналасқан басқа жарық фильтрі препарат шығаратын флуоресценция сәулелерін өткізе отырып, көк және ультракүлгін сәулелерді сіңіреді. Жарық көзі ретінде күшті ультракүлгін сәулесін бөлетін сынап шамдары және қыздыру шамдары қолданылады.

Жарық энергиясын сіңіру кезінде бірқатар заттарға жарқырау (флуоресценттік, люминесценттік) қасиеті тән. Флуоресценция спектрі флуоресценцияны қоздыратын сәулелерге қатысты үлкен толқындар жағына қарай ығысады. Бұл принцип қысқа толқындардың аймағында флуоресценциялаушы объектілері анықталып, қарауды қамтамасыз етеді. Мұндай микроскоптардың көкшіл-күлгін аймағында жарық беретін фильтрлер пайдаланылады.

Цитологиялық зерттеулерде ультракүлгін люминесцентті микроскоптар да пайдаланылады. Бұл әдісте тірі клеткаларға флуоресценттеуші заттарды енгізеді. Ол заттар клетканың белгілі бір құрылымдарымен байланысқа түсіп, олардың қайта люминесценциялануын туғызады.

Ультракүлгін микроскоптарында жеке флуоресценциялы объектілерді бақылауға болады.

Радиоавтография әдісі клеткадағы зат алмасу үрдісін зерттеуде қолданылады. Ол үшін фосфор, көміртегі, сутегі радиоактивті элементтер немесе олардың қосындылары пайдаланылады. Зерттеліп отырған ортаға немесе ағзаға метоболизм үрдісі кезінде, жасушалармен сіңірілетін радиоактивті изотоп енгізіледі. Изотоптардың радиоактивті сәулеленуі салдарынан олардың орныққан жерін анықтауға болады. Бұл әдісті қолдану кезінде клеткалардың жұқа кесінділерін үлбірге салады. Радиоактивті изотоптар бар жерлерде үлбір қараяды.

Изотопты енгізгеннен кейін біраз уақыт өткеннен соң, яғни метоболизмнің белгілі бір кезеңдері өткеннен кейін препарат даярланады. Заттардың таралуы нақты анықталады. Заттардың тек қана клеткада емес, сондай-ақ клетка мембраналарына орналасуларын анықтауда бұл әдістің мәні зор.

Поляризациялық микроскоптың көмегімен изотропты объектілерді (бөліну ұршығының талшықтарын, микрофибрилдерді және т.б.) зерттейді.

Мұндай микроскоптың конденсорының алдында поляризатор орналастырылады, ол белгілі полярлану жылдамдығы бар жарық толқындарын өткізеді. Препарат пен объективтен кейін полярланудың сол жазықтығымен жарық өткізе алатын анализатор орналастырылады. Қиысқан призмалар ортасында сәулені екі есе сындыратын объекті орналасқаннан кейін, объект қараңғы аумақта жарқырап көрінеді. Поляризаторлық микроскоп көмегімен өсімдік клеткасының қабықшасында мицеллийлердің орналасуын қарастыруға болады.

Рентген сәулелерін дифракциялау әдісі. Рентген сәулелері кристалдар арқылы өткен кезде дифракцияға ұшырайды. Олардың осы қасиеті рентген сәулелерін дифракциялау әдісінің негізін қалайды. Егер кристалдардың орнына биологиялық объектілер, мысалы, сіңір, целлюлоза немесе тағы басқа объектілерді қолданған кезде, олар тура сондай дифракцияға ұшырайды. Бұл жағдайда экранда немесе фотоүлбірде дақтар мен жолақтардан түзілген сақиналар қатары пайда болады.

Дифракция бұрышы объектідегі молекулалар мен атомдар топтарының арақашықтығымен анықталады. Құрылымдық бірліктер арасындағы қашықтық неғұрлым алшақ болса, дифракция бұрышы соғұрлым аз болады, немесе, керісінше, зерттеліп отырған заттың атомдары мен молекулаларының арасындағы арақашықтық аз болса, дифракция бұрышы үлкен болады. Ал экранда бұл қара түсті зоналар мен орталықтар арақашықтықтарына сәйкес келеді.

Бұл әдістің атомдар мен молекулалардың топтарының кеңістікте таралуын анықтауда және заттың ішкі құрылымы туралы мәлімет алуда мәні зор.

Электронды микроскопия әдісі. Электронды микроскоптың құрылысы жарық микроскоп тәрізді, бірақ жарық шоғының ролін электронды шоқ атқарады, бұл шоқ линзалармен емес, электромагниттермен фокусталады. Дегенмен, электрондар шоғы үшін толқындар ұзындығы, көзге көрінетін жарық толқындар ұзындығына қарағанда неғұрлым қысқа, осы қасиеті электронды микроскоптың шешуші қабілеттілігін арттырады. Қазіргі электронды микроскоптардың шешуші қабілеті – 0,2-1 нм.

Электронды микроскоптың астында тірі емес объектілер, яғни препараттар қарастырылады. Объектілер тірі ағзалардың өлуін тудыратын вакуумға салынады. Вакуумда электрондар шашырамай объектіге бірден түседі.

Электронды микроскоптан қарастырылатын объектілердің жұқалығы 400-500 Å-нен қалың бо