Адам туберкулезінің серологиялық балауында моноклоналды антиденелерді колдана отырып ИФТ және ИФР әдістерін кою

Осы зерттеудің максаты адамдар қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді анықтау үшін ИФТ «жанама» және «бәсекелі» қойылымдарын ИФР-ын жүргізу шарттары мен техникасын жетілдіру болып табылады. Осыған байланысгы біз Мусоbacterium tuberculosis-тың ақуызды антигеніне антиденені табу үшін ИФТ-дың сезімталдығына физико-химиялык факторлардың (температура, иондык күш және реакциялык ортаның рН маңызы, өзара байланысу ұзактығы, концентрациялық катынасы) әсерін зерттедік.

Туберкулез микобактерияларына телімді антиденелерді ИФТ «жанама» қойылымымен анықтау сызбасы негізгі 5 кезеңнен тұрады:

1 – ші кезеңде -антиген катты фазага адсорбцияланады.

2 – ші кезеңде — зерттеуге алынған материал кұрамындағы антиденелер катты фазаға адсорбцияланған антигенмен спецификалық байланысады да «антиген+антидене» иммунды кешенін кұрайды.

3-ші кезең — ферментпен танбаланған антиденелер (конъюгат) «антиген+ антидене» кешенімен телімді байланысып, «антиген+антидене+конъюгат» иммунды кешеніні пайда болады.

4-ші кезең — субстрат ерітіндісінің көмегімен «антиген+антидене+ конъюгат» иммунды кешенін анықтау. Бұл кезенде, реакция нәтижесі оң болған жағдайда субстрат сұйықтығының түсінің өзгеруі байқалады.

5-ші кезең — реакция нәтижесін немесе ферменттік реакция өнімдерінің оптикалық тығыздығын спектрофотометрдің көмегі арқылы бағалау.

ИФТ-дың «бәсекелі» койылымында антиген қатты фазаға адсорбцияланған моноклоналды антиденелермен байланысып реакция кезеңі бір сатыға артады.

Әрбір кезеңнің оңтайлы параметрлерін анықтау үшін ИФТ-ды бес рет қайталап жүргіздік.

Зерттеу нәтижелері бойынша ИФТ-дың жеткілікті сезімталдығын камтамасыз ететін Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигенінің оңтайлы концентрациясы 5-10 мкг/мл-ді көрсетті. Антигендердің концентрациясын әрі қарай жоғарылату реакцияның телімсіз боялуының артуы мен препараттарды ұтымсыз жұмсауға алып келді. Алынған нәтижелерді талдау барысында колданылған барлық ақуызды антигендердің ИФТ-ға қажетті қатты фазада жақсы сорбцияланатындыгын дәлелдейді.

Біз иммунды ферментті талдауда бірінші антидене мен антиген ретінде қолданылатын Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау үшін бірқатар тәжірибе жүргіздік. Моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау барысында моноклоналды антиденелердің концентрациясы 10 мкг/мл болған жағдайда полистиролды планшет шұңқыршықтарының белсенді орталыктарының толық инактивацияланатындығы айкындалды. Моноклоналды антиденелердің анағұрлым жоғары концентрациясын колдану препараттарды орынсыз жұмсалуына әкеліп соқтырды. Моноклоналды антиденелерді катты фазамен толық байланыстыру үрдісі 37°С температурада 1 сағатта аяқталды. Сонымен катар, сенсибилизацияны 4°С температурада 16 сағат бойы жүргізген жағдайда да жаксы нәтижелерге кол жеткіздік. Түрлі буферлі ерітінділердің рН-ның мәнін МКА қатты фаза беткейінде адсорбциялануына, «МКА+антиген+телімді антидене+конъюгат» кешенінің пайда болу реакциясына әсері түрлі иондық күш (2,0-ден 10,0-ға дейінгі) диапазоны зерттелінді. Буферлік жүйе ретінде зерттеуге рН 2.0 жэне 4,0 болатын натрий-ацетатты ерітіндісі, рН 7,0 және 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітінді, рН 9,5 және 10,0 болатын натрий-карбонатты буфері алынды. Тәжірибелер нәтижелері бойынша, ИФТ-да реакциялық сұйықтықтың боялу карқындылығы буферлі ерітінділердің рН мәніне тікелей тәуелді, яғни олардың рН-ы 7,0-10,0 аралығында болған жағдайда жоғары көрсеткіштерге қол жеткіздік. ИФТ қоюда антиген мен зерттелетін антидене арасындағы, сонымен қатар «антиген-антидене» иммунды кешені мен иммунды пероксидазалы конъюгат арасындағы тепе-тендік айтарлыкқтай маңызды орын алатындығы белгілі. Катты фаза беткейіне адсорбцияланған антиген мен МКА байланысу кинетикасын бағалау +37°С температурада 30 минут, 1, 2, 3 және 4 сағат аралығында жүрг ізілді.

Антиген-антидене реакциясындағы тепе-теңдік 2 сағат инкубацияланғаннан кейін пайда болып, оларды оптикалык тығыздығы 0,980- 1.044 о.б. кұрады. Экстинцияның жоғарылауы катты фаза беткейімен ақуыздың телімсіз байланысуының арқасында «фондық» көрсеткіштің 20-40% артуына алып келді.

Түрге қарсы пероксидазалық конъюгат пен антиген+антидене кешенінін байланысын бағалау нәтижесінде жүйелер арасындағы тепе-теңдік +37^°С температурада 1 сағат бойы инкубациялау барысында байқалды. Ал, реакциялык сұйыктықтың оптикалық тығыздығы 0,930-0,950 о.б. шамасында ауытқып отырды. Негативті бақылау сарысуын қолданған жағдайда бұл көрсеткіш 0,370-0,390 о.б. шамасында болды. 1 сағаттан артық инкубациялау бақылауга койылған сынаманың оптикалық тығыздық шамасының 30-35%-ға артып «фондық» боялудың өсуіне алып келді.

Біз антитүрлік конъюгаттардың (флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) «Сигма» шығарған (ФРГ) «антиген-антидене» кешенімен байланысу кинетикасына әсер ету ұзақтығы мен тәртібін зерттедік (8-кесте).

Кесте 8 — ФИТЦ-пен МКА-ді конъюгациялау шарттары

Кестеден көргеніміздей 1 мг МКА-де ФИТЦ-тің анағұрлым үйлесімді мөлшері 30-40 мкг кұрады. Экспозициянын жоғарылауы ФИТЦ бояғышы коспаларының болуына байланысты «фондық» көрсеткішінің 40-60%-ғы артатындығы байкалды.

Иммунды флюоресцентті конъюгатты қолдану барысында телімсіз байланысудың (боялу) анағұрлым төмен дәрежесі мен флюоресценция максималды жұмыс сұйылтымы 1:50-ге жетті.

Иммунды флюоресцентті реакциясының тікелей әдісін қажетті жағынды микобактериядан заттық шынысының бетінде дайындалды.

Туберкулезге шалдыққан науқастардан алынған биологиялық материалдың барлығы 10 сынамасы «бэсекелі» ИФТ және ИФР әдістерімен зерттелді. Бакылау ретінде Циль-Нильсен әдісімен боялған жағындылар микроскопиясы мен тығыз қоректік орталарда өсірілген Мусоbacterium tuberculosis культурасы анықталды (9-кесте).

Кесте 9 — Туберкулезге алынған сынамаларды зерттеу нәтижелері